Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга»

Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга»

^ Материалы и оборудование. Хим стаканы, пробирки, мерные цилиндры от 5 мл до 2 л, пробирки, пипетки от 0,01 мл до 10 мл либо дозаторы, весы аналитические до 500 г, весы торсионные Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» до 100 мг, пинцеты, ножницы, шпатели, электроплитки, магнитные мешалки, хим реактивы либо готовые маточные смеси макро- и микросолей, витаминов, фитогормонов.

^ Ход работы.

  1. В хим стакан емкостью 2 л поместить 20 г сахарозы, долить дистиллированной Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» водой до 400 мл и растворить.

  2. Добавить к раствору сахарозы 50 мл маточного раствора макросолей, 1 мл микросолей, 5 мл хелата железа, 5 мл хлористого кальция.

  3. Приготовить агар: навеску 7 г поместить в стакан и залить водой до 200 мл Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга», растворить, нагревая плитке либо газовой горелке, при неизменном помешивании. Готовый агар долить к раствору солей.

  4. Питательную среду довести до подходящего объема (1 л) дистиллированной водой. Измерить pH среды: если pH превосходит 5,5-6,0 добавить Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» несколько капель 0,1 н HCl, если ниже этого значения – 0,1 н КОН.

  5. Готовую питательную среду разлить в пробирки, около 25мл, закрыть их фольгой.

  6. Поместить пробирки в автоклав и проавтоклавировать.

  7. Железные инструменты завернуть в плотную Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» бумагу и поместить в сушильный шкаф для стерилизации сухим жаром при to 170-200oС в течение 2 часов.

  8. Чашечки Петри, пробирки с питательной средой, вату, марлю, фильтровальную бумагу, пробирки с дистиллированной водой (закрытые фольгой) поместить в Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» автоклав.

  9. Автоклав привести в рабочее состояние: закрыть плотно крышку, воду залить до метки. Включить автоклав, давление пара довести до метки 1,2 атм. (в паровой камере), заполнить паром стерилизационную камеру, вытеснить конденсат в течении Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» 10 минут, при всем этом давление пара в стерилизационной камере должно быть на уровне 0,1-0,2 атм. Довести давление в стерилизационной камере до 1 атм., включить автоматический режим.

  10. Автоклавировать 20 минут при давлении в Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» стерилизационной камере 1-1,2 атм.

  11. Отключить автоклав, вытеснить пар из обеих камер довести давление до 0 атм.

  12. Проавтоклавированные материалы перенести в комнату для пересадки тканей и поместить в шкафы либо на стеллажи.



4. Типы эксплантов:

Методы Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» получения и способы стерилизации


4.1. Выделение апикальных меристем

В культуре тканей можно размножать растения и получать оздоровленный (безвирусный) посадочный материал. Для оздоровления растений употребляют культуру апексов либо культуру апикальных меристем, потому что в стеблевой апекс вирусы попадают Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» медлительнее, чем в другие части растений. При культивировании апексов размножение вирусов угнетается реакцией растительного организма на травму, вызванную отсечением вершины.

В in vitro употребляются апексы верхушечных и боковых почек (точек роста Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга»), кончиков корней (в особенности проростков). ^ Апикальная меристема — группа меристематических (образовательных) клеток, организованных в ростовой центр, занимающая терминальное положение в побеге либо корне и обеспечивающая образование всех органов и первичных тканей. Высшая часть апикальной меристемы Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» представлена инициалями (единственной клеткой — у хвощей и многих папоротников и многоклеточной структурой — у семенных растений). Наиблежайшие производные инициальных клеток нередко выделяют в зону протомеристемы. Прямо за ней лежат ткани, уже Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» отчасти дифференцированные, но всё ещё находящиеся в меристематическом состоянии, которые относят к отчасти детерминированной первичной меристеме. Зависимо от производимых ею систем тканей детерминированная меристема включает последующие клеточные комплексы: тунику, образющую в предстоящем Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» первичную покровную ткань (эпидермис) и часть первичной коры, и корпус, клеточки которого равномерно сформировывают комплекс проводящих тканей (центральный цилиндр); в корне — дерматоген, дифференцирующийся в первичную покровную ткань (ризодермис); периблему — будущую первичную Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» кору; плерому — центральный цилиндр. Таким макаром, будущий ход развития меристематических тканей отчасти детерминирован уже самим размещением их в апексе побега и корня.

Обычно на питательные среды высаживают маленькую часть меристемы до 0,5 мм. В целом закономерность Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» такая: чем меньше величина меристемы, тем больше возможность получения безвирусных растений. Ее выделение осуществляется в ламинар-боксе с внедрением препаравальных инструментов под повышением бинокулярного микроскопа.




Рис. Апикальная меристема в верхушечной Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» почке побега элодеи (^ Elodea canadensis):

А - продольный разрез; Б - конус нарастания (внешний облик и разрез); В - клеточка первичной меристемы; Г - клеточка из сформировавшегося листа (1 - конус нарастания, 2 - первичный бугорок, 3 - вторичный бугорок - бугорок Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» пазушной почки, 4 – примордии - зачаточные листьев).




Фото Апикальная меристема лилейника





Рис. Апикальная меристема в кончике корня:

1 - калиптроген, 2 - дерматоген, 3 - периблема, 4 - плерома, 5 - ряд клеток, из которых появляется стела, 6 - сброшенные чехликом клеточки, 7 - колумелла.


Культивирование растений из апикальных меристем позволяет Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» получать безвирусный оздоровленный посадочный материал фактически всех сельскохозяйственных культур. Более много разработана разработка получения безвирусного картофеля. Так система первичного семеноводства и оздоровления посадочного материала картофеля включает последующие этапы: подготовка клубней Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» для вычленения апикальных меристем, вычленение апикальных меристем, регенерация растений из меристем, адаптация растений-регенерантов в защищенном грунте, получение первой продукции безвирусного материала в открытом грунте, выкармливание безвирусного посадочного материала в первичных звеньях Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» семеноводства, сохранение коллекции видов.

В культуре тканей употребляются апексы верхушечных и боковых почек. Чтоб исключить воздействие метаболитов клубня на проростки и повысить регенерационную способность начального материала из средней части клубня вырезают глазки Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» с частью паренхимы (1,5 х 1,5 см). Глазки проращивают на песке, за ранее обработанном сухим жаром. Этиолированные проростки выращивают в мгле при температуре 25±2оС, влажности воздуха 70-80 %. Песок два раза в денек увлажняют, через 7-10 дней проводят подкормку веществом Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» Кнопа.

Апикальные меристемы проростков изолируют на 12-13 пластохроне (просвет времени меж инициациями 2-ух листовых бугорков). Изолированные меристемы культивируют в асептических критериях на питательных средах с богатым содержанием макро- и микросолей, с завышенной Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» концентрацией цитокининов (6-БАП 2 мг/л). В культуральной комнате с кондиционированным воздухом поддерживают температуру 25±2оС, влажность воздуха 70 %, освещенность 5 кLx и фотопериод 16 часов.

В среднем от посадки меристемы на среду до формирования Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» проростков с 5-6 листочками проходит 30-45 дней, в неких случаях от 2 до 8 месяцев. Среды по мере истощения обновляют, и проростки временами пересаживают на новые среды в стерильных критериях.


^ 4.2. Выделение клеток, их групп и тканей.

Регенерацию растений из Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» культуры тканей можно получить, используя один из 3-х способов: культуру эмбрионов, органогенез, соматический эмбриогенез. Соматический либо неполовой эмбриогенез представляет собой процесс формирования зародышеподобных структур из соматических клеток. Соматический эмбрион - это независящая двухполюсная Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» структура, на физическом уровне не прикрепленная к ткани, из которой она происходит. Такие эмбрионы в предстоящем могут развиваться и создавать регенеранты через стадии, соответствующе тем, что встречаются при развитии зиготы. Схожее Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» явление можно повстречать у многих видов растений в критериях in vitro при работе с культурами разных типов клеток, тканей и органов, тогда как в природе такие процессы происходят снутри семяпочки.

При соматическом эмбриогенезе Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» переноса каллуса на среду без регуляторов роста обычно бывает довольно для стимуляции более поздних стадий развития эмбриона и его следующего прорастания. Образование соматических эмбрионов из культур клеток, тканей и органов может происходить Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» прямым либо непрямым методом. Прямой соматический эмбриогенез заключается в формировании вегетативного эмбриона из одной либо нескольких клеток ткани экспланта без стадии образования промежного каллуса. Такое явление наблюдается у цитрусовых Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга», где ткани нуцеллуса дают начало нуцеллярным эмбрионам. Есть данные о прямом эмбриогенезе в неких культурах пыльников и протопластов. Но по сопоставлению со вариантами непрямого эмбриогенеза эти случаи редки.

Непрямой эмбриогенез состоит из нескольких Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» шагов: помещения экспланта в культуру, следующей стимуляции роста каллуса и формирования предзародышей (обычно на среде, содержащей высочайшие концентрации ауксинов), и переноса каллуса на питательную среду без регуляторов роста, для того чтоб индуцировать формирование биполярных Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» эмбрионов из предзародышей. При подходящих критериях эти эмбрионы прорастают и образуют растения - регенеранты. Каллус по собственной природе гетерогенен и может состоять из клеток многих типов, включая инициали предзародышей. Инициали Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» предзародышей могут состоять из одной клеточки либо представлять собой многоклеточные образования. Когда каллус переносят на среду с низким содержанием ауксина, происходит процесс предстоящего эмбриогенеза, при котором появляется огромное число предзародышёй, а ранее сформировавшиеся инициали Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» предзародышей развиваются в биполярные эмбрионы. Развитие эмбрионов происходит асинхронно.

Формирование соматических эмбрионов может быть достигнуто методом использования соответственной питательной среды, критерий культивирования и отбора экспланта. Соматический эмбриогенез моркови представляет собой Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» традиционный пример регенерации растений по типу непрямого соматического эмбриогенеза. У моркови фактически неважно какая часть растения (корень, черешок листа, лист, ствол либо зиготический эмбрион) продуцирует эмбриогенный каллус. Из свежеизолированных эксплантов моркови и из линий каллусных Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» клеток методом манипуляций со средой культивирования можно индуцировать образование соматических эмбриоидов. При развитии этих соматических эмбриоидов наблюдаются обычные стадии развития (глобула и торпедо). совпадающие со стадиями развития оплодотворенной яйцеклетки Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» в зародышевом мешке развивающегося семени моркови. Это явление может служить одним из доказательств тотипотентности клеток высших растений. Морфогенетическая способность клеток в культуре клеток при длительном культивировании обычно меняется. В клеточках моркови, к примеру, она Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» может на сто процентов пропадать через 30-40 недель после изолирования экспланта, но конфигурацией состава сред культивирования ее можно вернуть. Это значит, что генетическая информация, нужная для эмбриогенеза, всегда находится в клеточках и, что есть Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» определенные эпигенетические причины, которые нужны для регуляции соматического эмбриогенеза в культуре клеток моркови. В данной работе изучают эффект 2-ух компонент среды культивирования на соматический эмбриогенез в закончивших рост каллусных Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» линиях моркови.


^ 4.3. Получение микрочеренков

Внедрение микрочеренков при клональном размножении растений in vitro имеет более обширное распространение. В качестве черенков в большинстве случаев употребляются просыпающиеся почки либо вершины юных побегов. В неких случаях употребляются Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» листовые черенки – растения способные продуцировать особи из фрагментов листьев либо их черешков (сенполии, стрептокарпусы, бегонии царские, сансивьеры и др.)



Фото Типы стеблевых черенков для введения в in vitro



Фото Типы листовых черенков для введения в in Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» vitro


^ 4.3. Получение микрочеренков.

Внедрение микрочеренков при клональном размножении растений in vitro имеет более обширное распространение. В качестве черенков в большинстве случаев употребляются просыпающиеся почки либо вершины юных побегов. У корневищных многолетников (хосты, ветреницы Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга», астильбы, акониты и др.) употребляют подземные почки корневища. У луковичных листовые чешуи (лилии) либо центральные почки (нарциссы, цветки) луковиц. В неких случаях употребляются листовые черенки – растения способные продуцировать особи Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» из фрагментов листьев либо их черешков (сенполии, стрептокарпусы, бегонии царские, сансивьеры и др.). При всем этом основным является отбор черенков на исходных шагах сезонного роста. В этот период их инфицирование существенно меньше и завышенный Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» гормональный фон содействует более действенному введению.

При внедрении таких черенков in vitro употребляется этапная стерилизация начального материала с внедрением спирта, перекиси водорода и хлорсодержащих препаратов. При успешном внедрении в последствии предстоящее их клонирование Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» осуществляется с внедрением микрочеренков, которые представляют собой нарезанные куски побегов с 1-3 узлами, либо отделенные пучки маленьких побегов, обильно нарастающих в базальной части. Тот же метод размножения может быть применен и с растениями Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» стерильными после развития растений из калюсных культур. Микрочеренки отделяются от материнского клона и рассаживаются в новые пробирки с агаризованной средой. При достижении ими «товарных» размеров их высаживают на среду Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» с завышенным фоном ауксинов (0,5-3,0 мг/л) для окончательного укоренения. После этого растения готовы к посадке из пробирок на почвенный субстрат и адаптации к нестерильным условиям. Этот метод существенно уменьшает сроки процесса размножения (минуя Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» стадии калюсообразования), но при всем этом не происходит очищение материала от вирусов.

Этот метод размножения основан на формирование адвентивных почек и побегов. Способность к индукции адвентивных почек в обыденных критериях встречается Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» у неких видов растений (к примеру, в роде бегония). Такая индукция в значимой степени определяется содержанием гормонов в среде либо постоянным механическим повреждением верхушечной почки механически (срезкой верхушек). Итог - снятие апикального преобладания Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» и закладка адвентивных почек. Этот способ уже стал фабричным при производстве посадочного материала неких культур. Эта модель более детально была отработана на картофеле.

При работе с картофелем в большинстве случаев пользуются черенкованием Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга». Для этого выросший в пробирке из меристемы побег расчленяют с соблюдением стерильности на куски размером 0,5-1,0 см, любой из которых обязан иметь листочек и пазушную почку.

Эти черенки сразу помещают на питательную среду такого же состава Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» для доращивания и укоренения. При всем этом среда может быть как плотной (т.е. с агаром), так и водянистой. Как высаженные черепки сформируют из пазушной почки новый побег, последний вновь Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» черенкуют.

Таким макаром, из ограниченного числа «меристемных» растений за несколько месяцев можно получить огромное количество безвирусного посадочного материала (за полгода- 30000). При всем этом за каждый цикл черенкования оно растет и 4-5 раз. По Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» воззрению многих исследователей, методы размножения на базе снятия апикального преобладания имеют наименьшую степень риска в отношении получения неоднородного потомства. Частота возникновения мутантных форм (в расчете на число новообразований) тут не превосходит частоту Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» возникновения таких при размножении растения обыкновенными способами. Данный метод получает все большее распространение в практике. Он универсален и отличается относительно высочайшей воспроизводимостью приобретенных результатов.


^ 4.4. Стерилизация эксплантов и введение в «in vitro»

С целью получения Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» эксплантов для каллусной и опухолевой культур, микроклонального размножения, исследования гормональной регуляции употребляют стерильные проростки. Семечки для проращивания высевают или на воду, или на питательную среду.

Растительные объекты перед стерилизацией кропотливо отмывают Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» проточной водой, время от времени с моющими средствами, очищают от лишних тканей. С корнеплодов и корней снимают кожицу, с побегов – кору, с почек – кроющие чешуи.

Растительные экспланты стерилизуют смесями веществ, содержащими Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» активный хлор (хлорамином, гипохлоритом Nа), бром (бромной водой), tween-20, перекисью водорода, спиртом, нитратом серебра, диацидом, антибиотиками. Следует подбирать такие концентрации стерилизующих агентов, которые не повреждали бы сами семечки, не угнетали их всхожесть Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» и обеспечивали наивысшую стерильность.

Этиловый спирт нередко используют для подготовительной стерилизации, протирая им поверхность материала либо погружая материал на несколько секунд в абсолютный спирт. Время от времени таковой стерилизации довольно, ее употребляют при Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» работе с плодами, семенами, побегами, завязями.

Гипохлорит кальция (хлорная известь) употребляется в виде 5-7 % раствора для обработки почек, завязей, растений, семян, побегов в течение 5-8 минут.

Гипохлорит натрия употребляется в виде 0,5-5 % раствора для обработки Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» всех эксплантов в течение 1-20 минут. Это вещество является клеточным ядом, потому время стерилизации и концентрацию подбирают экспериментально. К примеру: для изолированных эмбрионов употребляют 2-3 % раствор в течение 10-15 минут, а для сухих семян 3-5 % раствор в Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» течение 1 часа. Остатки гипохлорита натрия поначалу убирают 0,01 н HCl, а потом 8 раз промывают автоклавированной дистиллированной водой.

Хлорамин используют в концентрации 1-6 %. Пыльники и юные эмбрионы обрабатывают в течение 1-3 минут, сухие Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» семечки – 30-60 минут, потом промывают стерильной дистиллированной водой 2-3 раза.

Сулема – ядовитое вещество и просит особенной тщательности, как при хранении, так и при подборе концентрации для отдельных объектов. Для стерилизации эмбрионов употребляют 0,1 % раствор в течение Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» 1-3 минут, для корне- и клубнеплодов – до 10-20 минут.

Смеси, содержащие активный хлор употребляются 1 раз и готовят их конкретно перед работой.

Диацид употребляется в 0,2 % растворе для стерилизации корнеплодов, семян, кусочков, тканей, верхушечных меристем, изолированных эмбрионов, пыльников Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга». Диацид готовят, растворяя раздельно 330 мг этанолмеркурхлорида и 660 мг цетилпиридиния хлорида в жаркой воде (330 мл), потом их соединяют и доводят объем воды до 1 л, добавляют несколько капель детергента твин-80; хранят в Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» плотно закрытой пробирке в мгле.

Лекарства используют для стерилизации растительного материала, инфицированного микробами (ткани корончатогалловых опухолей). Более нередко используют стрептомицин и тетрамицин 10-80 мг/л, ампициллин 200-400 мг/л, левомицитин, каномицин и другие Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга».

В качестве стерилизующего агента используют также перекись водорода, которая наименее всего повреждает экспланты и после которой не требуется отмывка в стерильной воде, потому что она стремительно разлагается.

Стерилизацию эксплантов нужно проводить в стерильных (асептических) критериях Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга»: в ламинар-боксе.

Пробирки с эксплантами после помещаются в абсолютную мглу при комнатной температуре на неделю для выявления степени стерильности. Те пробирки, в каких началось инфецирование, следует сходу удалять.


^ Лабораторная Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» работа № 3

Тема: «Выделение эксплантанта апекса побега картофеля и введение его in vitro»

Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, пробирки с питательными средами, стерильные препарировальные иглы, пинцеты, скальпели, флакон с 96 % спиртом, спиртовка, вата, 6 % раствор NaClO2, пробирки Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» с автоклавированной дистиллированной водой, чашечки Петри, побеги картофеля.

^ Ход работы.

  1. Взять клубни картофеля с возрастающими «глазками». Отделить возрастающий побег провести его стерилизацию.

  2. Стерилизованный побег (на стерильной чашечке Петри) в ламинар-боксе Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» поместить в поле зрения бинокулярного микроскопа.

  3. При малом увеличении в центральной части разреза почки отыскать удлиненный конус нарастания с вершиной округленной формы. Над конусом нарастания виден вроде бы свод, образованный зачаточными Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» листьями (примордии), идущими от основания почки.

  4. Препаровальной иглой (режущие иглы от шприца) изолировать апикальную меристему (конус) на 12-13 пластохроне (просвет времени меж инициациями 2-ух листовых бугорков) и перенести на стерильную среду.

Изолированные Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» меристемы культивируют в асептических критериях на питательных средах с богатым содержанием макро- и микросолей, с завышенной концентрацией цитокининов (6-БАП 2 мг/л). В культуральной комнате с кондиционированным воздухом поддерживают температуру 25±2оС, влажность воздуха 70 %, освещенность 5 кLx Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» и фотопериод 16 часов.

В среднем от посадки меристемы на среду до формирования проростков с 5-6 листочками проходит 30-45 дней, в неких случаях от 2 до 8 месяцев. Среды по мере истощения обновляют, и проростки временами Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» пересаживают на новые среды в стерильных критериях.


^ Лабораторная работа № 4

Тема: «Клонирование отдельных тканей растений моркови»


Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, пробирки с питательной средой, скальпели, пинцеты, ножницы, препарировальные иглы, спиртовка, флакон с Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» 96 % спиртом, стерильная пленка, чашечки Петри.

Ход работы.

  1. Приготовить ламинар-бокс и инструменты к работе.

  2. Кропотливо отмыть морковь под струей воды.

  3. Порезать морковь по 100мм в длину в стакан и залить стерильным веществом на Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» 30 минут.

  4. Перенести в ламинар-бокс.

  5. Отрезать от моркови с обоих концов куски размером 20мм и затеп перенести их в чашечку Петри.

  6. Скальпелем порезать объект на диски шириной 1мм и размером 4мм Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» х 4 мм.

  7. Поместить экспланты на питательную среду и убрать на черные стеллажи.

  8. Проводить наблюдение каждые 7 дней, результаты зарисовать.



^ Лабораторная работа № 5

Тема: «микрочеренкование стерильных проростков»

Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, пробирки с проростками, пробирки с Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» питательной средой, скальпели, пинцеты, ножницы, препарировальные иглы, спиртовка, флакон с 96 % спиртом, стерильная пленка.

Ход работы.

  1. Приготовить ламинар-бокс и инструменты к работе.

  2. В ламинаре извлечь стерильные проростки из пробирок.

  3. Побеги поделить Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» на микрочеренки (междоузлие с почкой) и высадить в питательную среду на глубину междоузлия.

  4. Пробирку закрыть пленкой и перенести в культуральную комнату.

  5. Результаты зарисовать через 2-4 недели. Сделать выводы о степени пролиферации почек разных сельскохозяйственных Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» культур.



Контрольные вопросы к теме

1. Какие стерилизующие смеси употребляются для растительных экс-плантов?

2. Какие вещества входят в состав питательных сред, и какую функцию они делают в культуре клеток и тканей in Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» vitro?

3. Как получают стерильные проростки и зачем их употребляют?

4. Из каких областей экспланта появляется каллус?


Глава 5. Культивирование растительного материала in vitro


^ 5.1. Главные принципы культивирования

Согласно систематизации Мурасиге (1977), процесс микроклонального размножения можно производить последующими способами:

1. Активация пазушных Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» меристем.

2. Образование адвентивных побегов тканями экспланта.

3. Появление адвентивных побегов в каллусе.

4. Индукция соматического эмбриогенеза в клеточках экспланта.

5. Соматический эмбриогенез в каллусной ткани.

6. Формирование придаточных эмбриоидов в ткани первичных соматических

эмбрионов Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» (деление первичных эмбриоидов).

^ Основной способ, использующийся при микроклональном размножении растений - активация развития уже имеющихся в растении меристем. Он основан на снятии апикального преобладания.

Этого можно достигнуть 2-мя способами:

а) удалением верхушечной меристемы Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» стебля и следующим микрочеренкованием побега in vitro на безгормональной среде;

б) добавлением в питательную среду веществ цитокининового типа деяния,

индуцирующих развитие бессчетных пазушных побегов. Обычно, в качестве цитокининов употребляют 6-бензиламинопурин (БАП) либо Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» 6-фурфуриламинопурин (кинетин) и зеатин.

Приобретенные таким макаром побеги отделяют от первичного экспланта и вновь без помощи других культивируют на свежеприготовленной питательной среде, стимулирующей пролиферацию пазушных меристем и появление побегов более больших порядков Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга». Нередко в качестве экспланта употребляют верхушечные либо пазушные почки, которые изолируют из побега и помещают на питательную среду с цитокининами. Образующиеся пучки побегов делят, по мере надобности черенкуют и переносят на свежайшую питательную среду. После Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» нескольких пассажей, добавляя в питательную среду ауксины, побеги укореняют in vitro, а потом переносят в почву, где делают условия, содействующие адаптации растений.

В текущее время этот способ обширно употребляется в производстве посадочного Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» материала сельскохозяйственных культур, как технических, так и овощных, также для размножения культур промышленного цветоводства (к примеру, гвоздики), тропических и субтропических растений, плодовых и ягодных культур, древесных растений.

^ 2-ой способ - индукция появления Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» адвентивных почек конкретно тканями экспланта. Он основан на возможности изолированных частей растения при подходящих критериях питательной среды восстанавливать недостающие органы и таким макаром регенерировать целые растения. Можно достигнуть образования адвентивных Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» почек практически из всех органов и тканей растения (изолированного эмбриона, листа, стебля, семядолей, чешуек и донца луковиц, частей корней и зачатков соцветий). Этот процесс происходит на питательных средах, содержащих цитокинины в соотношении с ауксинами 10:1 либо Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» 100:1. В качестве ауксина употребляют ИУК либо НУК. Таким методом были размножены многие представители семейства лилейных, томаты, древесные растения (из зрелых и незрелых эмбрионов).

^ 3-ий способ, практикуемый при клональном микроразмножении Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга», основывается на дифференциации из соматических клеток зародышеподобных структур, которые по собственному виду напоминают зиготические эмбрионы (рис. 2). Этот способ получил заглавие соматического эмбриогенеза. В отличие от развития in vivo, соматические эмбрионы развиваются асексуально вне зародышевого мешка Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» и по собственному внешнему облику напоминают биполярные структуры, у каких сразу наблюдается развитие апикальных меристем стебля и корня. Согласно Стеварду, соматические эмбрионы проходят 3 стадии развития: глобулярную, сердцевидную, торпедовидную и в Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» итоге имеют тенденцию развития в проросток.

^ 4-ый способ клонального микроразмножения - дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани (рис. 3).

Фактически он не много употребляется с целью получения посадочного материала in vitro. Это связано Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» с тем, что при нередком пассировании каллусной ткани может изменяться плоидность регенерируемых растений, наблюдаются структурные перестройки хромосом и скопление генных мутаций. Вместе с генетическими переменами отмечаются и морфологические: низкорослость, неверное Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» жилкование листьев, образование укороченных междоузлий, пониженная устойчивость к заболеваниям и вредителям. В то же время, некие недочеты этого способа в селекционной работе оборачиваются преимуществами. Не считая того, в неких случаях он Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» является единственно вероятным методом размножения растений в культуре тканей. Через каллусную культуру удачно плодятся сладкая свекла, злаковые, представители рода Brassica, подсолнечник и другие культуры.


^ 5.2. Каллусогенез в культуре растительных клеток и тканей

Каллусная ткань - один из Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» видов клеточной дифференцировки, появляется методом неорганизованной пролиферации дедифференцированных клеток органов растения. У растений в природе каллусная ткань появляется в исключительных обстоятельствах (к примеру, при травмах) и работает недолговременное время. Эта ткань защищает место Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» поранения, может копить питательные вещества для анатомической регенерации либо регенерации утраченного органа.

Образование каллуса не всегда связано с травматическим воздействием. Каллус может появиться и в итоге пролиферации внутренних тканей экспланта без Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» связи с поверхностью среза из-за нарушения гормонального баланса. Возрастающий каллус разрывает слои ткани и развивается на поверхности. Для получения культивируемых каллусных клеток куски тканей разных органов высших растений - корней, листьев, стеблей Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга», пыльников, эмбрионов (экспланты) помещают на искусственную среду, содержащую ауксины, в пробирки, пробирки, чашечки Петри (in vitro).

Одними из важных гормонов, используемых при культивировании in vitro, являются ауксины, которые активируют деление и растяжение Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» клеток. Проникая в клеточки, ИУК связывается со специфичными сенсорами, оказывая воздействие на многофункциональную активность мембран, рибосом и работу ядерного аппарата. В качестве ауксинов употребляют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), нафтилуксусную кислоту (НУК Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга»), индолил-масляную кислоту (ИМК), индолилуксусную кислоту (ИУК) в концентрации 0,5 - 10 мг / л, зависимо от вида экспланта.

Для регенерации растения из каллуса либо экспланта употребляют среды с более высочайшим содержанием цитокининов. К более употребимым Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» относятся: 6-бензиламинопурин (БАП), зеатин, 6-фурфуриламинопурин (кинетин).

Процессу образования каллуса предшествует дедифференцировка тканей экспланта. При дедифференцировке ткани теряют структуру, соответствующую для их специфичных функций в растении, и ворачиваются к состоянию делящихся клеток. Если эксплант, применяемый Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» для получения каллуса, является куском органа, то имеет в собственном составе эпидермальные клеточки, клеточки камбия, сосудистой системы, сердцевинной и первичной коровой паренхимы. В большей степени пролиферируют клеточки камбия, коры, сердцевинной паренхимы.

Клеточки Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» в культуре могут существовать в 2-ух видах: в виде суспензии в водянистой питательной среде и на поверхности жесткой питательной среды в виде каллуса. Поверхностное культивирование производят на жесткой агаризованной среде.

Каллусная Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» ткань, выращиваемая поверхностным методом, представляет собой бесформенную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго определенной анатомической структуры. Цвет массы может быть белоснежным, желтым, зеленоватым, красноватым. Зависимо от происхождения и критерий выкармливания каллусные Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» ткани бывают:

- рыхловатые, очень оводненные, просто распадающиеся на отдельные клеточки;

- средней плотности, с отлично выраженными меристематическими очагами;

- плотные, с зонами редуцированного камбия и сосудов. Обычно, в долговременной культуре на средах, содержащих ауксины, каллусные ткани Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» теряют пигментацию и становятся рыхловатыми.

В цикле выкармливания каллусной ткани клеточки после ряда делений приступают к росту растяжением, дифференцируются как зрелая каллусная ткань и деградируют. Для того, чтоб не Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» вышло старения, утраты возможности к делению и предстоящему росту, также отмирания каллусных клеток, первичный каллус переносят на свежайшую питательную среду через 28 - 30 дней, другими словами проводят пассирование либо субкультивирование каллусной ткани.

Появление физиологических и структурных Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» различий меж клеточками и тканями растений, связанное с их многофункциональной специализацией, именуют процессом дифференциации. Понятие «дифференциация» отражает перевоплощение эмбриональной, меристематической клеточки в специализированную. Меристематические клеточки, однотипные по структуре и функции, начинают развиваться разными Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» способами, создавая ткани различных органов.


^ 5.3. Суспензионные культуры

Суспензионные культуры – это одиночные клеточки, маленькие, средние и большие агрегаты (группы клеток), выращиваемые в водянистой питательной среде при неизменной аэрации (доступ кислорода) в Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» асептических критериях. Суспензии получают из каллусов. Для инициации суспензионной культуры нужно 2-3 г свежайшей рыхловатой массы каллусных клеток на 60-100 мл водянистой питательной среды. Первичную суспензию культивируют в колбах с водянистой питательной средой на Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» радиальных качалках со скоростью 100-120 об./мин.

Суспензионные культуры обширно употребляются в качестве модельных систем для исследования путей вторичного метаболизма, индукции ферментов и экспрессии генов, деградации чужеродных соединений, цитологических исследовательских работ и др.

Модельная кривая роста Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» суспензии имеет S-образную форму и включает: лаг-фазу, экспоненциальную фазу, стационарную фазу и фазу деградации. Форма реальных ростовых кривых отличается длительностью фаз. Это находится в зависимости от генетики популяции Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга», количества инокулюма и состава питательной среды. Скорость нарастания биомассы колеблется от 15 до 70 суток.

Суспензии употребляют для получения принципиальных хим веществ: органических кислот, ферментов, алкалоидов, красителей, белков, аминокислот, которые используются в фармакологии, парфюмерии, пищевой и Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» хим индустрии, сельском хозяйстве.

Суспензионные культуры имеют огромное значение для генетики и в особенности молекулярной биологии: из суспензионных клеток получают протопласты, нужные для соматической гибридизации, генетической инженерии, также для Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» исследования метаболизма клеток.

Культивирование растительных клеток в водянистой питательной среде при неизменном смешивании лишено многих недочетов, характерных культивированию каллусных клеток на агаризованных жестких средах. Неизменное движение растительных клеток в водянистой среде упрощает газовый обмен, решает Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» задачи питательного градиента и полярности роста клеток. Большая часть суспензионных культур можно получить методом переноса кусочков рыхловатого каллуса в перемешиваемую водянистую среду такого же состава, что и среда, на Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» которой выращивался каллус. Для каждой полосы суспензионной культуры клеток существует малый размер инокулюма (числа пересеваемых клеток), при наименьшем размере которого суспензионная культура клеток не вырастает. С уменьшением размера инокулюма возрастает длина лаг-фазы. Суспензионные Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» культуры клеток растений обширно употребляются в качестве модельных систем для исследования путей вторичного метаболизма, индукции ферментов и экспрессии генов, также как начальный материал для выделения ферментов. Принципиальным их преимуществом при выделении ферментов Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» либо товаров вторичного метаболизма является отсутствие практически у всех суспензионных культур клеток хлорофилла и каротиноидных пигментов. В связи с тем, что суспензионные культуры клеток, в главном, состоят из относительно гомогенной популяции клеток, которые Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» можно стремительно обрабатывать при помощи добавляемых в среду культивирования хим веществ, они очень комфортны для биохимических тестов, проводимых при исследовании метаболизма уводимых веществ, также для выделения и свойства мутантов.


5.4. Микрочеренкование.

Микроклональное размножение Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» минзурочных растений производят при помощи черенкования. Такое размножение основано на угнетении апикального преобладания и активации пазушных меристем при удалении вершины побега. Из пазушных почек на питательных средах образуются побеги Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга». Растения, сформировавшие 5-6 листочков, в стерильных критериях извлекают из пробирок и разрезают на части (отрезок стебля с листом и пазушной почкой). Черенки высаживают на глубину междоузлия в питательные среды или без гормонов, или с добавлением Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» ауксинов.

Черенки культивируют в тех же критериях, что и меристемы: при температуре 24-25оС деньком и 19-20оС ночкой, освещенности 5-6 кLx и длительности фотопериода 16 часов.

Рост стебля и корней начинается на 3-4 денек Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» после посадки на питательную среду, а на сто процентов растения формируются через 12-15 дней.

Каждое следующее черенкование проводят через 14-20 дней. Из 1-го растения можно получить 5-8 черенков, а через 2-3 месяца – 3-5 тыс. черенков.

Нижнюю часть растения употребляют для Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» ИФА. Растения, зараженные вирусами, бракуют, а здоровые дают начало мериклонам (меристематическим клонам).

Если почки либо черенки посадить на питательные среды с высочайшим содержанием цитокининов, то появляется конгломерат почек и побегов Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга». Приобретенные побеги просто отделяются друг от друга, их можно или укоренить, или использовать для предстоящего микрочеренкования.

Для укоренения растений, образовавшихся при микрочеренковании, их нужно пересадить на новейшую питательную среду. Черенки и побеги просто укореняются Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» на средах с обедненным составом минеральных солей (среда Уайта, Мурасиге-Скуга, разбавленная в два раза), или на средах с добавлением ауксинов: ИУК, НУК, ИМК.

Проростки, сформировавшиеся в пробирках со средами, можно Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» рассматривать как маленькие укорененные растения, которые нужно адаптировать к обыденным условиям выкармливания. Такие растения лучше пересаживать в грунт, когда стопроцентно сформируются 5-6 листьев и довольно разрастутся корешки. Но, различные виды культурных растений по Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга»-разному адаптируются к изменению критерий среды. Каждое растение просит специально подобранных критерий культивирования в грунте, которые устанавливают экспериментально.




tema-rol-kollektiva-v-vospitanii-lichnosti.html
tema-rol-vospitatelya-v-razvitii-samostoyatelnoj-muzikalnoj-deyatelnosti-detej.html
tema-rossiya-bila-spasena-narodom.html